液相色谱手动or自动积分？这是有讲究的！

一、关于手动积分的指南

关于手动积分，并没有指南给出明确的定义。笔者只查到有两篇生物样本分析的方法验证指南规定了再积分（Reintegration）的注意事项。

FDA的2001年定稿指南 Bioanalytical Method Validation，及相应的2013年草案指南也有类似的要求。生物样本分析的方法验证2013草案指南，第III.C节“样本数据再积分”规定：SOP应该确定再积分的标准，和怎样进行再积分；应清楚描述、并记录再积分的理由；应报告原始和再积分数据。第VII.D节还规定：再积分数据应有管理人员授权再积分。

EMA的2011年指南 Guideline on bioanalytical method validation，第5.5节规定：应该有SOP描述色谱的积分和再积分。应在分析报告中讨论偏离这个SOP的任何偏差。应该记录色谱积分、再积分的积分参数、初始积分数据、最终积分数据，并在要求时立即可得。

二、什么情况下可以进行手动积分？

1）低分离度或低响应；

2）流动相不稳定，基线紊乱，保留时间变化小； 

3）运行过程中，出现异常峰； 

4）软件积分的局限性，如由于软件参数阈值的设置导致峰未积分，峰起点和终点间出现肩峰和异常的基线漂移，软件错误（峰未积分和错误识别峰）；

5）由于样品母体的干扰导致的复杂色谱图：裂峰、目标杂质的同时洗脱/肩峰、基线噪音、负峰、基线上升或下降（由于某些梯度程序）、峰的严重拖尾、烃类的存在导致自动积分不正确。

三、手动积分的权限及操作

操作员在数据系统自动积分不正确时，领取手动积分处理报告表并填写，手动积分申请被QC经理批准后由QC经理或QC组长（若有）或其指定人员（一般是指经验丰富的资深QC）方可进行手动积分。

四、手动积分注意事项

1）手动积分不能试图通过以下动作来使数据符合标准要求：减少峰（减少峰面积）；增加峰（增加峰面积）；改变峰高；

2）同一次检验的所有标准品、工作对照品、样品等必须使用同一方法进行手动积分。

3）手动积分结束后，应打印自动积分图谱和手动积分图谱附于手动积分申请表之后，提交QC经理审核；QC经理应复核完整的数据找出根因，基于根因制定相应的CAPA措施来避免类似事件。

4）自动积分的图谱不得删除或被覆盖，应与手动积分图谱一起保存于计算机中；打印的自动积分图谱和手动积分图谱应标识清楚签名，随同手动积分申请表附于检验原始记录后面一起交质量管理部经理、QP审核无问题后归档。

五、色谱软件选型、权限设置和结果显示

满足合规要求的色谱软件（例如Waters和Angilent的软件），能够分别设置不同权限，例如普通化验员不具备进行手动积分的权限，需要主管进行操作，有些软件则不具备这些功能；即使是同一个品牌的软件，也有不同版本；即使软件有这个功能，企业也不一定启用。

有两个信息是否显示，对色谱数据透明度非常重要：方法名称和数据版本。

如果企业不使用手动积分（重画基线），而采用修改参数的方式，则每修改一次，是不同的方法（规范的管理程序会要求更改方法名称保存，否则就只能到审计追踪才能查出来这个方法已经被修改了），而打印的色谱图可以选择是否显示方法；每处理一次数据，会形成一个数据版本，同样的，打印的色谱图可以选择是否显示数据版本。

一个完全透明的结果显示，会在打印的色谱图上显示“方法名称+数据版本”（同时要求修改参数则改变方法名称，不需要QA或检查员仔细检查审计追踪才能发现修改痕迹）。

我们已经讨论了关于峰积分发布的相关法规，主要的积分参数，和重新积分的三个原则，满足这些我们能对峰进行自动积分而没必要进行手动积分。但是，现在我们需要把注意力转向手动积分。正如我们从法规引文和生物分析指南文件看到的，我们需要的是控制、管理批准自动/手动积分的SOP。

手动积分的定义应该确定。但是我没有找到一个可以使用的关于手动积分的定义。无论是Dyson还是在所有法规网站中都没有。Hill et al. (7) 中提到过，他讨论了手动积分的范围和专业术语，他们都说有必要对其定义进行统一。问题是，没有统一。

这就出现了一个重要问题：如果我们不能定义手动积分，怎样在整体上编写一个关于积分的SOP？

本着拓荒者的精神，本文将提出一个可能的方法来编写SOP，以流程图的形式讨论了手动积分和自动积分的一些选项。当然，这有一些担忧，因为拓荒就是作死的节奏啊。

但是，我希望本文的观点能够引发一个关于手动积分的大讨论，使我们能够得到一个统一的定义。

在这个讨论中我们需要平衡各种科学合理的法规符合性。因此，让我们提出一个问题看看哪一个更糟糕：

当你知道结果错误的时候没有重新积分，或者你看到样品色谱图中有未知峰，然而你接受了错误的结果？

你看到困境了吗？我们知道这些情况是不可取的，但是死板的程序或者对法规的担忧使得科学判断不能行驶。

首先，让我思考一个“不允许手动积分”的观点，个人认为这是一个站不住脚的观点，特别是受控的实验室使用近期开发的方法分析杂质，且定量限或检测限接近基线噪音，或者在研究产品的稳定性时。这些情况手动积分都是科学合理的并且在积分SOP中可以涵盖的。

在图1是关于积分考虑的建议性流程图。它在色谱运行完成时开始，通过初始处理方法进行峰的自动积分。

色谱工作人员对色谱结果进行复核：保留时间和峰的性状都是否和预期一致？峰是否能够被正确鉴别？基线位置是否符合分析程序？样品按照标准进行积分？个别实验室可能有其他标准。

现在我们需要决策：运行是否可接受？如果是，就计算各个的结果和报告的数值，一切都好。所有数据都通过CDS进行自动计算，色谱工作人员仅需要确认软件所做的符合预期期望就可以了。

但是，如果积分不能接受我们需要进行第二个决策：该分析程序是否允许手动积分（无论该术语包含哪些内容）？如果不能，下一阶段就是实验室调查。我们应该考虑使用哪些方法不能手动积分吗？

如果是APIs(active pharmaceutical ingredients)的检测或对最终产品的活性成分的注册方法呢？如果这些峰不能被正确积分，你就没辙吗？我们将在完成这个流程图讨论的时候思考这是否站得住脚？

我认为，在以下情况手动积分是禁止使用的。

• 有可以接受基线的对称峰，基线拟合后可以自动积分。

• 增加或消减峰面积以符合SST（适用性试验）接受标准或者允许运行符合测试标准。

现在我们来谈谈什么是手动积分，图1 提出了3个观点进行讨论，你的实验室SOP根据所进行的工作可能包含更多内容。你所需要的结果是一致的，并适当的手动积分是科学合理的。因此我们需要避免一些不一致和不适当的积分。

图1中情况1和2表明手动干预，情况3是手动积分。让我来说明以下我的理由

• 情况1：峰超出了界面，他们不能被正确识别。自动积分是可以接受的，所需要的是改变积分方法的峰界面并重新处理。通过这个方法峰面积并没有改变。

• 情况2：积分参数或处理方法需要调整，然后适用于运行中的所有进针。一个例子可能改变超过阈值角或最小面积来减少对基线噪音的影响。在这种情况下峰面积可能改变也可能不变，但是基线并没有被分析师手工处理。

• 情况3：在进行杂质分析时，因为后期出现的峰（late running peak：拖尾峰？）或噪音，可能需要色谱工作人员手动处理基线。通过重新积分峰面积将会改变。